Недавно биологам удалось обнаружить в клетках молекулы РНК в необычной кольцевой форме и установить, как именно они работают. Экзотический вид нуклеиновых кислот уже прозвали молекулами-губками из-за их способности адсорбировать другие регуляторные РНК и таким образом подавлять их активность. За последние пятнадцать лет изучение РНК превратилось в область перманентной революции, но даже на этом фоне последнее открытие выглядит знаковым событием.
По своей химической структуре звенья РНК отличаются от нуклеотидов более известной родственницы, ДНК, всего одним атомом — дополнительным кислородом (а также заменой тимина на урацил и наличием порой некоторых нестандартных оснований). Тем не менее роли двух нуклеиновых кислот в клетке существенно различаются. Если ДНК является «генеральным планом», «оригиналом» генома, то РНК выступает только в роли рабочей копии, временного носителя, который после нескольких циклов использования уничтожается. По крайней мере именно такой взгляд, зафиксированный в так называемой «основной догме молекулярной биологии», господствовал в первые годы существования этой дисциплины. Сегодня ученые понимают, что на самом деле с РНК все гораздо сложнее и интереснее.
Надо сказать, свидетельств того, что РНК может выполнять гораздо более широкие функции, нежели просто быть «рабочей копией генома», с самого начала было предостаточно. Стоит упомянуть хотя бы тот факт, что сами рибосомы — молекулярные машины, в которых происходит синтез полипептидов, — состоят из РНК, причем нуклеиновая кислота занимает в них центральную часть. Кроме того, синтез белка невозможен без участия транспортных РНК — специальных адапторов, которые одной стороной присоединяются к РНК-копии гена, а другой стороной соединены с нужной аминокислотой. Да и в теломеразе, удлиняющей концы хромосом, также присутствует РНК.
За несколько лет, прошедших после открытия Уотсоном и Криком двуспиральной структуры ДНК, биологам удалось привить находившееся до того момента в воздухе дерево генетики к корню биохимии. Ученые показали, как именно загадочные гены могут проявлять себя во внешних признаках. Это понимание было оформлено в концепции, получившей слегка помпезное наименование «Основной догмы молекулярной биологии». Обычно она формулируется в виде схемы ДНК->РНК->Белок, подразумевающей однонаправленный поток информации: ДНК контролирует последовательность РНК, которая синтезируется буквально на ее основе (этот процесс называют транскрипцией — переписыванием). А последовательность РНК диктует рибосомам последовательность синтезируемого белка. Открытие РНК-содержащих вирусов слегка усложнило эту схему, но общая ее концепция оказалась удивительно живучей.
Что касается некодирующих РНК, как мы сейчас их понимаем — малых молекул с регуляторными функциями, то они впервые были обнаружены в конце 1960-х годов.
О том, как это произошло, рассказал Дмитрий Александрович Крамеров, заведующий Лабораторией эволюции геномов эукариот в Институте молекулярной биологии имени Энгельгардта.
«В 1968 году Харрис Буш и его сотрудники с одной стороны, а также Роберт Вайнберг совместно с Шелдоном Пенманом с другой стороны обнаружили молекулы длиной всего 90-300 нуклеотидов, которые не были похожи ни на матричные, ни на транспортные РНК. Исследователи просто разделяли в гелях всю РНК, которую им удалось выделить из клеток млекопитающих, и случайно обнаружили эти относительно короткие молекулы. Их было значительно меньше, чем известных к тому моменту рибосомных и матричных РНК, но все-таки не так уж и мало.
И вот, на протяжении многих лет Буш и его сотрудники медленно и мучительно определяли последовательность этих молекул, одну за другой. Тогда они еще не знали, какие функции могут выполнять эти странные короткие РНК. В некотором смысле ученые работали на будущее. Впервые какую-то функцию у таких РНК удалось обнаружить только при исследовании сплайсинга. Это открытие принадлежит очень сильной женщине-ученому Джоан Стейтс».
Сплайсинг — это процесс, в ходе которого матричные РНК, непосредственно «переписанные» с ДНК, подготавливаются к тому, чтобы стать основой для синтеза белка. Из них вырезаются лишние участки — интроны. Оказалось, что в процессе вырезания этих вставок участвуют малые некодирующие РНК. Белки в этом тоже участвуют, вместе с РНК они образуют большой комплекс, проводящий вырезание, — сплайсосому (структуру сплайсосомы удалось установить сравнительно недавно). Но именно РНК — они называются U1, U2, U4, U5 и U6 — выполняют здесь основную работу.
Большая субъединица рибосомы, состоящая из РНК (кремового цвета) и белка (синего). Видно, что РНК является основой этой машины трансляции, а белок — всего лишь «довесок», играющий вспомогательную роль.
David S. Goodsell
Следующая малая РНК, функцию которой удалось установить, оказалась занята в процессе, никак не связанном со сплайсингом. «Практически одновременно появились первые работы по так называемым 7SL-РНК, которые входят в состав комплексов, отвечающих за экспорт белков из клетки, — SPR-частиц, — продолжает Крамеров. — Эти РНК присоединяются к первым аминокислотам белков, которые требуется экспортировать, и связывают их со специальным каналом. Это необходимо, например, для выделения пищеварительных ферментов или выработки белков крови. У каждого из таких „идущих на экспорт“ белков первые аминокислоты представляют собой определенную сигнальную последовательность, что-то вроде „разрешения на вывоз“. Вот эта 7SL-РНК как раз связывается с такой последовательностью и обеспечивает экспорт».
Со временем стало понятно, что малые некодирующие РНК встречаются в совершенно разных сферах клеточной деятельности: сплайсинг, синтез белка, экспорт белка. Были открыты малые ядрышковые РНК — молекулы, которые участвуют в модификации нуклеотидов рибосомальной РНК. Чем дальше, тем больше становилось разнообразие таких молекул, однако все они были достаточно специализированными, и такие исследования не привлекали широкого внимания. «Поначалу работа двигалась очень медленно. Например, выяснение роли 7SK-РНК, одного из регуляторов синтеза матричной РНК, заняло около пятнадцати лет. Однако в последнее десятилетие новый вид малых РНК открывают чуть ли не каждый год», — рассказывает ученый.
Все изменилось относительно недавно, в 1998 году, когда Эндрю Файр и Крейг Меллоу открыли явление РНК-интерференции — способа управления работой генов, который осуществляется за счет так называемых малых интерферирующих РНК, или siRNA. Эта работа практически произвела революцию в молекулярной биологии. Во-первых, был обнаружен совершенно новый, неизвестный механизм регуляции работы генов. А во-вторых, что немаловажно, новый механизм можно было немедленно применить на практике. Возможно, именно поэтому Нобелевскую премию Файр и Меллоу получили уже в 2006 году — спустя всего восемь лет после открытия.
В общих чертах механизм РНК-интерференции выглядит следующим образом. Как известно, для того чтобы синтезировать белок, нужно сначала снять одноцепочечную РНК-копию гена с ДНК в ядре. Созревшая матричная РНК поступает в цитоплазму, где находятся рибосомы. Однако если в клетку мы каким-то образом внесем маленькие фрагменты рибонуклеиновой кислоты, имеющие точно комплементарную последовательность нужной нам конкретной матричной РНК, то они присоединятся друг к другу. Получится локальный димер, дуплекс, и такие РНК очень не по нраву всякой клетке.
Дело в том, что источником появления в клетке дуплексов РНК может быть либо заражение некоторыми вирусами, либо избыточная продукция внутренних эгоистических элементов - ретротранспозонов. Поэтому даже маленький кусочек такого дуплекса клетка рассматривает как опасный сигнал — и полностью его уничтожает. В ходе этого процесса разрушается не только та самая молекула РНК, которая образовала дуплекс, но и все остальные молекулы с такой же последовательностью. Если двуцепочечная РНК, которую мы внесли в клетку, совпадает по последовательности с каким-либо геном, то все РНК-копии, снятые с этого гена, также уничтожаются.
Взрослая особь и эмбрион Caenorhabditis elegans. С работ на этом черве (а параллельно и на мухе-дрозофиле) началось открытие механизма РНК-интерференции.
Nathan Goehring/Goehring et al. (2011) J. Cell Biol. 193, 583-594.
Внешне действие РНК-интерференции выглядит как «выключение» гена, хотя ДНК, где записана последовательность этого гена, оказывается нетронутой. Эффективность процесса у некоторых организмов настолько велика, что червя Caenorhabditis elegans, например, достаточно просто окунуть в раствор нужных siRNA — и определенный ген полностью отключится во всех его клетках. В практическом плане открытие РНК-интерференции дало в руки ученым настоящий «пульт управления» геномом, который позволяет выключать нужные гены прямо во время эксперимента, без отбора специальных мутантов.
Со временем, когда механизм РНК-интерференции стали исследовать, обнаружилось много процессов, с ним напрямую не связанных, а как бы находящихся «вокруг» него. Прежде всего, помимо преимущественно антивирусного механизма интерференции, обнаружился механизм сайленсинга, заставляющего «молчать» определенные гены. Сам процесс сильно напоминает РНК-интерференцию, в нем участвуют очень похожие, но все же немного отличающиеся малые некодирующие РНК — микроРНК.
МикроРНК не имеют отношения к вирусам, а кодируются в самом геноме клетки в виде большего предшественника, который нарезается специальными ферментами на кусочки по 22 нуклеотида. Эти короткие молекулы точно так же присоединяются к своим управляемым матричным РНК, но при этом не приводят к их уничтожению, а «глушат» — не дают синтезировать с них белок. За счет использования микроРНК можно, например, накопить множество матричных РНК, которые будут до определенного момента неактивны. Затем их все одновременно можно включить, удалив микроРНК и сняв таким образом ингибирование.
С открытием кольцевых РНК (circRNA) ситуация усложнилась еще на один шаг. Как выяснили в новой работе первооткрыватели молекул-губок, микроРНК сами могут быть объектом ингибирования.
«Молекулы-губки имеют прямое отношение к микроРНК», — комментирует Николай Андреевич Чуриков, заведующий Лабораторией организации генома ИМБ РАН. «Это тот случай, когда мы имеем дело с ингибитором ингибитора. Как было показано в новых работах, кольцевые РНК содержат сайты связывания микроРНК и могут забирать на себя существенную часть этих молекул. Таким образом, они снимают действие микроРНК, которое в подавляющем большинстве случаев является тормозящим. Интересно, что одна кольцевая молекула-губка способна нести на себе сайты посадки разных микроРНК, специфичных к разным генам», — рассказал Чуриков.
Вообще говоря, то, что рибонуклеиновая кислота может существовать в кольцевой форме, было известно давно. Такие кольца образуются при вырезании интронов у ядерных организмов — в процессе сплайсинга, о котором уже заходила речь ранее. Однако в случае обычных интронов кольцевая форма — это просто промежуточное соединение, она быстро разрушается, не выполняя никаких функций. В данном же случае, хотя механизм образования кольца и похож, циклические молекулы выполняют важную задачу — активируют гены, ингибированные микроРНК. С точки зрения биологии, а не химии кольцевые РНК — это действительно нечто совершенно новое.
«В данном случае двум независимым группам — обе их статьи опубликованы в одном номере Nature — удалось показать, что кольцевые РНК — это не недоразумение, что они выполняют важные функции. Например, обе экспериментально изученные РНК (анализ показал, что потенциально таких молекул могут быть тысячи) участвуют в формировании мозга, причем у самых разных животных — от рыб до мышей. И это продемонстрировали достаточно авторитетные, известные ученые. Одна из этих групп, кстати, — это лаборатория Раевского-младшего, его отец, Клаус Раевский, очень известный иммунолог. Интересно, что это потомки как раз тех самых Раевских, которые известны как друзья Пушкина. Помните, когда Александр Сергеевич лечился на Кавказе, он познакомился с Александром Николаевичем Раевским и тот поразил его воображение. Говорят, что „Демон“ написан под этим впечатлением».
Опыты на любимой биологами рыбке данио-рерио показали, что искусственный синтез большого количества кольцевых РНК приводит к такому же эффекту, как и полное удаление тех микроРНК, сайты посадки которых присутствуют на кольцевой молекуле. У мышей кольцевые РНК синтезируются в определенных областях мозга — неокортексе и гиппокампе, зонах, тесно связанных с формированием памяти.
Обнаружить кольцевые РНК удалось с помощью технологии глубокого секвенирования — RNAseq. Этот недавно появившийся метод позволяет за счет использования современных мощных секвенаторов определять последовательности не отдельных, специально выделенных молекул, а вообще всей РНК в клетке — всего транскриптома.
Интересно, что ранее, когда такой технологии не существовало, кольцевые РНК были практически недоступны для наблюдения. Дело в том, что для определения последовательности нуклеиновых кислот их сначала многократно копируют в ходе полимеразной цепной реакции. Перед этим на концы молекул обычно присоединяют специальные олигонуклеотиды-адапторы. У кольцевых молекул концов, естественно, нет, и адапторы пришивать не к чему. Поэтому такие молекулы длительное время просто «пролетали под радаром» исследователей.
Помимо технологии секвенирования всего транскриптома, для поиска кольцевых молекул понадобился специальный биоинформатический анализ, который может выискивать именно кольцевые молекулы. И хотя на данный момент показать функциональность удалось только для двух кольцевых молекул, анализ говорит о том, что их может быть очень много.
Эмбрион рыбки данио-рерио, любимый объект нейробиологов. На нем была показана важность функционирования кольцевых РНК для развития мозга.
Действительно, легко представить, что если в клетки потомства из яйцеклетки попадут регуляторные РНК, они смогут принести с собой определенную схему, паттерн активности генов. Причем, как выясняется, этот паттерн способен наследоваться на протяжении нескольких поколений.
«Яркий пример наследования приобретенных признаков в виде паттерна работы генов, приобретенного на протяжении жизни, хорошо показан на крысах, — рассказывает Чуриков. — Стрессовые условия содержания, приводящие к повышенному уровню гормона кортизола, у грызунов передаются от родителей к детям. Более того, признаки того, что крыс содержали в условиях стресса, отслеживаются на протяжении до четырех поколений. Уверен, что и у людей нечто похожее имеет место. Так что это следует иметь в виду, особенно тому, кто собирается иметь детей».
Очень похожие передающиеся через поколения эпигенетические эффекты показаны в области поведения и плодовитости животных. Точно такие же механизмы встречаются и у растений, и даже более широко, чем у животных.
Трофим Лысенко в поле
Малые РНК могут влиять на наследование через поколения не только сами по себе, но и опосредованно. Они могут изменять паттерн активации генов, влияя на расположение в хромосомах активных и пассивых зон. Такие зоны, содержащие в одном случае постоянно работающие, а в другом случае — как бы «заархивированные» гены, собраны в хромосомах в блоки. И некоторые виды некодирующих РНК способны включать или выключать целые блоки генов, привлекая к их границам соответствующие регуляторные белки.
Интересно, что при всей новизне открытых в последние 10 лет механизмов эпигенетической наследственности нельзя сказать, что их внешние проявления представляют собой нечто совершенно новое.
«Я был прошлой осенью в Бостоне на конференции, название которой переводилось примерно как „Наследование через поколения приобретенных признаков“, представляете, как это звучит для русского уха? — делится впечатлениями Чуриков. — Звучит это как что-то, сильно напоминающее идеи Трофима Денисовича Лысенко. Его там, кстати, иронически, но вспоминали, даже фотографии показывали. Такая, знаете, монументальная мраморная скульптура вместе со Сталиным. Конечно, история Лысенко, такая трагическая для отечественной биологии, — она не про идеи, а про отношение науки и власти. Ирония, однако, заключается в том, что, как мы теперь понимаем, он увидел эпигенетический феномен. Жаль, конечно, что правильное понимание роли и места эпигенетических механизмов, соотношение генетики и эпигенетики, пришло только сейчас».