Генная инженерия открывает перед человечеством возможности по созданию ранее не существовавших организмов и уничтожению генетических болезней. Однако все не так радужно, поскольку даже прорывная технология CRISPR/Cas9 работает далеко не идеально. Допускаемые ею ошибки могут быть редкими, но и одной достаточно, чтобы стать фатальной для человека. «Лента.ру» рассказывает о том, что не так с CRISPR и как ученые пытаются исправить ситуацию.
Система CRISPR/Cas9 — своеобразные ДНК-ножницы — по праву считается революцией в области генной инженерии. С ее помощью ученые могут редактировать человеческий геном, убирая из него вредные мутации, и лечить таким образом неприятные и смертоносные наследственные болезни. Не следует думать, однако, что раньше подобных методов не было. В арсенале у генетиков имелись, например, нуклеазы, содержащие цинковые «пальцы», и эндонуклеазы — ферменты, разрывающие молекулы ДНК в специфичных местах. В точности, универсальности и стоимости они ощутимо проигрывают CRISPR/Cas9, хотя и последняя далеко не совершенна.
CRISPR/Cas9 была изначально создана не учеными, а природой. Это молекулярный механизм, существующий внутри бактерий и позволяющий им бороться с бактериофагами и другими паразитами. Фактически он работает как иммунитет против инфекции. CRISPR (расшифровывается как «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами») — это особые участки (локусы) ДНК. В них содержатся короткие фрагменты ДНК-вирусов, которые когда-то заражали предков существующих ныне бактерий, но были побеждены их внутренней защитой. Эти фрагменты называются спейсерами, они отделены друг от друга повторяющимися последовательностями.
Когда бактериофаг проникает внутрь бактерии, каждая повторяющаяся последовательность и примыкающий к ней спейсер используются в качестве шаблона для синтеза молекул, называемых crРНК. Образуется множество различных цепочек РНК, они связываются с белком Cas9, задача которого крайне проста: разрезать ДНК вируса. Однако сделать это он сможет только после того, как crРНК найдет комплементарный ей фрагмент вирусной ДНК. После того как Cas9 разрывает чужеродную нуклеиновую кислоту, последняя уничтожается до конца другими нуклеазами.
СRISPR/Cas9 хороша именно своей точностью, ведь для бактерий правильная работа иммунитета — вопрос жизни и смерти. «Антивирусной» системе нужно найти участок вирусной ДНК среди миллиона других и, главное, не спутать его со своим собственным геномом. За миллионы лет эволюции бактерии довели этот механизм до совершенства. Поэтому сразу после того, как ученые выяснили, зачем нужна CRISPR-система, они поняли, что ее можно «приручить» в качестве беспрецедентно точного инструмента редактирования генов.
Чтобы произвести замену одного специфического участка в геноме на другой, необходимо синтезировать направляющую РНК, которая по принципу действия аналогична crРНК. Она указывает Cas9, где необходимо произвести двуцепочечный разрыв в ДНК модифицируемого организма. Однако нам нужно не испортить ген, а модифицировать его — например, заменить один или несколько нуклеотидов и убрать зловредную мутацию. Тут на помощь опять приходит природа. Естественные механизмы репарации тут же начинают восстанавливать перерезанную цепочку. Фокус в том, что для этого удаляются некоторые фрагменты РНК рядом с разрывом, после чего туда вставляются похожие последовательности. Ученые могут заменить их собственными последовательностями ДНК и таким образом модифицировать геном.
Схематическое изображение CRISPR
Изображение: Kaidor / Wikipedia
Однако нет ничего идеального. Несмотря на относительную точность, CRISPR-система иногда делает ошибки. Одна из причин лежит в самой природе системы. Бактерии невыгодно, чтобы crРНК совпадали на 100 процентов с фрагментом вирусной ДНК, который может отличаться на один-два нуклеотида. Для нее лучше, чтобы некоторые нуклеотиды могли отличаться, что дает микроорганизму больше шансов побороть инфекцию. В то же время в генной инженерии невысокая специфичность грозит ошибками: изменения могут быть внесены не там, где нужно. Если это произойдет в ходе экспериментов на мышах, то трагедии особой нет, но редактирование генома человека может обернуться катастрофой.
Этим объясняется озабоченность западных ученых экспериментами, которые проводятся в Китае. Азиатские исследователи прибегли к генным модификациям человеческих эмбрионов с помощью технологии CRISPR. Подобные опыты были запрещены в Европе и США, но недавно Великобритания разрешила их — исключительно в исследовательских целях. Такие эмбрионы должны будут уничтожаться через пару недель после получения, что исключает «выведение» ГМ-людей.
Однако CRISPR/Cas9 не была бы такой замечательной, если бы ее невозможно было усовершенствовать. Так, ученые научили Cas9 разрезать не две цепочки сразу, а только одну. Разрез вносится в двух различных местах ДНК-последовательности на разных цепях, поэтому система должна уметь распознавать в два раза больше нуклеотидов, чем обычно, что делает ее более точной.
Белок Cas и crРНК
Фото: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Ученые из университета Западного Онтарио нашли еще один способ усовершенствовать эту технологию. Они пытались решить проблему репарации разрезанной ДНК. Быстрое восстановление нуклеиновой цепочки приводит к тому, что ученые не успевают внести в геном свои исправления. Таким образом создается порочный круг: отремонтированную нежелательным образом цепочку вновь приходится разрезать белком Cas9.
Чтобы предотвратить такую ситуацию, исследователи модифицировали «белковые ножницы», создав белок TevCas9. Он разрезает цепочку ДНК в двух местах, что затрудняет восстановление участка. Для синтеза нового фермента к Cas 9 присоединили фермент I-Tevl, который также является эндонуклеазой, то есть белком, расщепляющим молекулу ДНК в середине, а не отщепляющим концы последовательности, как это делают экзонуклеазы. Полученный гибридный белок оказался более точен в связывании со специфичными участками и с меньшей вероятностью может ошибиться и разрезать не тот участок.
Кристаллическая структура Cas9, связанного с ДНК
Фото: Cas9 wiki project / Wikipedia
Повышать точность CRISPR-систем можно и другим способом. «Гонка вооружений» между бактериями и вирусами привела не только к развитию защитных систем у микроорганизмов, но и способов их обезвреживания. Так, бактериофаги быстро мутируют, лишаясь участков, по которым бактериальный иммунитет их распознает. Однако некоторые кодируют анти-CRISPR-белки, мешая работе комплекса crРНК и Cas9.
8 декабря в журнале Cell была опубликована статья ученых из Торонтского университета, которые создали «анти-CRISPR» — систему, которая позволяет выключить механизм при определенных условиях. Она позволяет предотвратить нежелательные ошибки, подавляя активность Cas9 в том случае, если направляющая РНК свяжется не с тем фрагментом. «Анти-CRISPR» состоит из трех белков, которые ингибируют нуклеазу и кодируются генами одного из бактериальных вирусов.
Уже сейчас технологию CRISPR используют для лечения таких серьезных заболеваний, как лейкоз и рак легких, а также испытывают для очистки иммунных клеток от ВИЧ. По мере того как ученые находят все новые способы совершенствования этого метода, будет открываться все больше возможностей его применения.