Биологи из Гарвардского университета в США закодировали в ДНК кишечной палочки первую в мире гифку, созданную в XIX веке. Исследователи воспользовались технологией CRISPR/Cas9, чтобы вставить в геном бактерии нуклеотиды, которые соответствуют составляющим изображение пикселям. Прочтение последовательности ДНК позволило воспроизвести ролик с 90-процентной точностью. Статья ученых опубликована в журнале Nature.
Эдвард Мейбридж может считаться создателем GIF-анимации. Он первым использовал фотоаппараты для получения ряда изображений. С помощью специального прибора — зоопраксископа — он делал из них короткие зацикленные ролики. Одна из его знаменитых работ — кадры со скачущей лошадью — пригодилась для решения спора, всегда ли при галопе животное касается хотя бы одной ногой земли (выяснилось, что нет). Хронофотография, изобретенная Мейбриджем, послужила основой кинематографа. Однако фотограф вряд ли предполагал, что его снимки попадут внутрь ДНК микробов (да и не знал он о ДНК).
Как же исследователи добились этого? Важную роль сыграла относительно недавно открытая система CRISPR/Cas9. Так называют молекулярный механизм, действующий внутри бактерий и позволяющий им бороться с вирусами. CRISPR — это находящиеся внутри ДНК микроорганизма «кассеты», которые состоят из повторяющихся участков и уникальных последовательностей — спейсеров, представляющих собой фрагменты вирусной ДНК. То есть CRISPR — это своего рода банк данных с информацией о генах патогенных агентов. Белок Cas9 использует эту информацию, чтобы правильно идентифицировать чужеродную ДНК и обезвредить ее, разрезав в определенном месте.
Протоспейсер соответствует той последовательности, что была когда-то «украдена» у вируса и стала спейсером. Ученые пользуются этим молекулярным механизмом. Спейсер кодирует crРНК, к которой затем прикрепляется белок Cas9. Вместо crРНК можно использовать синтетическую РНК с определенной последовательностью — направляющую РНК (sgРНК) — и указать «ножницам», где произвести нужный ученым разрез.
Бактерия получает спейсеры естественным образом, заимствуя у патогенных вирусов протоспейсеры. После того как фрагмент был встроен в CRISPR, протоспейсер становится знаком, позволяющим микроорганизму распознать инфекцию.
Однако применение CRISPR этим не ограничивается. Биотехнологи выяснили, что на эти «кассеты» можно записывать информацию при помощи заранее синтезированных протоспейсеров. Как и любая ДНК, протоспейсер состоит из нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре — A, T, C и G, однако их различные комбинации способны закодировать что угодно. Считываются такие данные методом секвенирования — определением нуклеотидных последовательностей в геноме организма.
Кишечная палочка
Фото: Manfred Rohde / HZI / DPA / Globallookpress.com
Сначала ученые закодировали четырехцветное и 21-цветное изображение человеческой руки. В первом случае каждый цвет соответствовал одному из четырех нуклеотидов, во втором — группе из трех нуклеотидов (триплету). Каждый протоспейсер представлял собой строку из 28 нуклеотидов, в которой содержалась информация о наборе пикселей (пиксете). Чтобы различать протоспейсеры, их отметили штрих-кодами из четырех нуклеотидов. Внутри штрих-кода нуклеотид кодировал две цифры (C — 00, T — 01, А — 10, G — 11). Так, CCCT соответствовал 00000001. Подобное обозначение позволяет понять, в какой части изображения располагается тот или иной пиксель данного пиксета.
Четырехцветное изображение руки состояло из 56x56 пикселей. Вся эта информация (784 байта) уместилась в 112 протоспейсеров. 21-цветное изображение было меньше (30х30 пикселей), поэтому ему хватило 100 протоспейсеров (494 байта).
Однако нельзя так просто внедрить в бактерию любую последовательность нуклеотидов, рассчитывая что она встроит ее в свою собственную ДНК со 100-процентной вероятностью. Поэтому комбинации нуклеотидов в триплетах были выбраны не случайно, а так, чтобы общее содержание G и C в строке было не меньше 50 процентов. Это увеличивало шансы приобретения спейсера бактерией.
Фото: Harry Ransom Center
Протоспейсеры внедрили в популяцию кишечной палочки (Escherichia coli) посредством электропорации — созданием пор в липидной мембране клеток бактерий под действием электрического поля. Бактерии обладали функциональными CRISPR и ферментным комплексом Cas1-Cas2, позволяющим создавать новые спейсеры на основе протоспейсеров.
Микроорганизмы оставляли на ночь, а на следующий день специалисты анализировали нуклеотидные последовательности в CRISPR и считывали значение пикселей. Точность прочтения достигала 88 и 96 процентов для четырехцветной и 21-цветной руки соответственно. Дополнительные исследования показали, что почти полное приобретение спейсеров происходило через два часа 40 минут после электропорации. Хотя некоторые бактерии погибали после процедуры, это не влияло на результат.
Ученые отметили, что некоторые спейсеры в бактериях встречались намного чаще, чем другие. Оказалось, что на это влияли нуклеотиды, находящиеся в самом конце протоспейсера, и образующие мотив (слабо изменчивую последовательность). Такой мотив, именуемый AAM (acquisition affecting motif), заканчивался триплетом TGA. Это биологи использовали, чтобы закодировать в бактериях анимацию. Были созданы пять 21-цветных кадров с бегущей лошадью, снятые американским фотографом Эдвардом Мейбриджем. Их размер — 36 на 26 пикселей.
Каждый кадр был закодирован набором из 104 уникальных протоспейсеров, а объем информации достигал 2,6 килобайта. Специальные нуклеотидные метки, позволяющие отличить последовательность одного кадра от последовательности другого, не предусматривались. Вместо этого применялись различные популяции бактерий. Таким образом, один-единственный организм в качестве носителя информации еще не использовался.
Ученые намерены усовершенствовать этот подход. Однако пока живые существа сильно проигрывают обычным информационным накопителям. Подобные исследования направлены прежде всего на выяснение вычислительных возможностей молекул ДНК, что может пригодиться для создания ДНК-компьютеров, способных одновременно решать огромное количество задач. Живые организмы — удобная платформа для научных изысканий, поскольку в них уже содержатся ферменты и другие вещества, необходимые для модификаций нуклеотидных цепочек.